Producten

Monogalactopyranosides van fluoresceïne en fluoresceïne-methylester: synthese, enzymatische hydrolyse door gebiotnyleerde β-galactosidase en bepaling van translationele diffusiecoëfficiënt

Fluoresceïnemonoglycosiden (d-galactopyranoside (FMG) en d-glucopyranoside) en hun methylester (MFMG) zijn in goede opbrengsten bereid uit acetobroomglucose/galactose en fluoresceïnemethylester.Enzymatische hydrolyse-experimenten (met gebiotinyleerde β-galactosidase) van de galacto-derivaten zijn uitgevoerd en kinetische parameters zijn berekend.Tijdens de hydrolyse is een 15-20-voudige toename van de fluorescentie-intensiteit waargenomen.Er is een lineaire toename van fluorescentie waargenomen bij een korte tijd en een lage substraatconcentratie, waardoor deze verbindingen bruikbare en gevoelige sondes voor galactosidasen zijn.De waarde van de Michaelis-Menten-constante (Km) voor MFMG is hoger dan die van FMG, wat een mogelijke conformatieverandering van het fluorogene substraat suggereert.De Km-waarde voor gebiotinyleerd β-Gal met FMG is lager dan die voor het natieve enzym.Deze waarneming wijst op een hogere substraataffiniteit van het gebiotinyleerde enzym in vergelijking met het natieve enzym.Translationele diffusiecoëfficiënten zijn gemeten, voor zowel fluorogene substraten als beide producten, met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.Er is gemeten dat translatiediffusiecoëfficiënten voor fluorogene substraten en de enzymatische hydrolyseproducten vergelijkbaar zijn, in het bereik van 3,5–4,5 × 10−10 m2 s−1.Een verbetering of vertraging van de enzymatische kinetiek als gevolg van een verschil in translatiemobiliteit van substraat en product is dus niet zo duidelijk.