nieuws

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) is een analoog van β-galactosidasesubstraat, dat zeer induceerbaar is.Onder de inductie van IPTG kan de inductor een complex vormen met het repressoreiwit, zodat de conformatie van het repressoreiwit wordt veranderd, zodat het niet kan worden gecombineerd met het doelwitgen en het doelwitgen efficiënt tot expressie wordt gebracht.Dus hoe moet de concentratie IPTG tijdens het experiment worden bepaald?Is hoe groter hoe beter?
Laten we eerst het principe van IPTG-inductie begrijpen: het lactose-operon (element) van E. coli bevat drie structurele genen, Z, Y en A, die coderen voor respectievelijk β-galactosidase, permease en acetyltransferase.lacZ hydrolyseert lactose tot glucose en galactose, of tot allo-lactose;lacY laat lactose in de omgeving door het celmembraan gaan en komt de cel binnen;lacA brengt de acetylgroep over van acetyl-CoA naar β-galactoside, wat inhoudt dat het toxische effect wordt verwijderd.Daarnaast is er een bedieningssequentie O, een startsequentie P en een regulerend gen I. De I-gencode is een repressoreiwit dat kan binden aan de positie O van de operatorsequentie, waardoor het operon (meta) wordt onderdrukt en uitgeschakeld.Er is ook een bindingsplaats voor katabole genactivatoreiwit-CAP-bindingsplaats stroomopwaarts van de initiërende sequentie P. De P-sequentie, O-sequentie en CAP-bindingsplaats vormen samen het regulerende gebied van het lac-operon.De coderende genen van de drie enzymen worden gereguleerd door hetzelfde regulerende gebied om de gecoördineerde expressie van genproducten te bereiken.

Bij afwezigheid van lactose bevindt het lac operon (meta) zich in een staat van onderdrukking.Op dit moment bindt de lac-repressor die tot expressie wordt gebracht door de I-sequentie onder de controle van de PI-promotersequentie aan de O-sequentie, wat voorkomt dat RNA-polymerase aan de P-sequentie bindt en transcriptie-initiatie remt;wanneer lactose aanwezig is, kan het lac operon (meta) worden geïnduceerd. In dit operon (meta) systeem is de echte inductor niet lactose zelf.Lactose komt de cel binnen en wordt gekatalyseerd door β-galactosidase om te worden omgezet in allolactose.De laatste bindt zich als een inducermolecuul aan het repressoreiwit en verandert de eiwitconformatie, wat leidt tot de dissociatie van het repressoreiwit van de O-sequentie en transcriptie.Isopropylthiogalactoside (IPTG) heeft dezelfde werking als allolactose.Het is een zeer krachtige inductor, die niet door bacteriën wordt gemetaboliseerd en zeer stabiel is, dus wordt het veel gebruikt in laboratoria.

Hoe de optimale concentratie van IPTG bepalen?Neem E. coli als voorbeeld.
De genetisch gemanipuleerde E. coli BL21-stam die de positieve recombinant pGEX (CGRP/msCT) bevatte, werd geïnoculeerd in vloeibaar LB-medium dat 50 ug·mL-1 Amp bevatte, en overnacht gekweekt bij 37°C.De bovenstaande kweek werd geïnoculeerd in 10 flessen van 50 ml vers vloeibaar LB-medium dat 50 µg·ml-1 Amp bevatte in een verhouding van 1:100 voor expansiekweek, en toen de OD600-waarde 0,6-0,8 was, werd IPTG toegevoegd aan de uiteindelijke concentratie.Het is 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Na inductie bij dezelfde temperatuur en dezelfde tijd werd er 1 ml van de bacteriële oplossing uit genomen en werden de bacteriecellen verzameld door middel van centrifugatie en onderworpen aan SDS-PAGE om de invloed van verschillende IPTG-concentraties op eiwitexpressie te analyseren, en vervolgens selecteer de IPTG-concentratie met de grootste eiwitexpressie.
Na experimenten zal blijken dat de concentratie IPTG niet zo groot mogelijk is.Dit komt omdat IPTG een bepaalde toxiciteit heeft voor bacteriën.Overschrijding van de concentratie zal ook de cel doden;en over het algemeen hopen we dat hoe meer oplosbaar eiwit tot expressie wordt gebracht in de cel, hoe beter, maar in veel gevallen zal er een grote hoeveelheid insluiting worden gevormd wanneer de concentratie van IPTG te hoog is.Lichaam, maar de hoeveelheid oplosbaar eiwit is afgenomen.Daarom is de meest geschikte IPTG-concentratie vaak niet hoe groter hoe beter, maar hoe lager de concentratie.
Het doel van inductie en cultivering van genetisch gemanipuleerde stammen is om de opbrengst van het doeleiwit te verhogen en de kosten te verlagen.De expressie van het doelwitgen wordt niet alleen beïnvloed door de eigen factoren van de stam en het expressieplasmide, maar ook door andere externe omstandigheden, zoals de concentratie van de inductor, de inductietemperatuur en de inductietijd.Daarom is het in het algemeen het beste om, voordat een onbekend eiwit tot expressie wordt gebracht en gezuiverd, de inductietijd, temperatuur en IPTG-concentratie te bestuderen om de juiste omstandigheden te selecteren en de beste experimentele resultaten te verkrijgen.