Producten

Nieuwe hoogwaardige vloeistofchromatografietest voor glycosyltransferasen op basis van derivatisering met anthranilzuur en fluorescentiedetectie.

Assays werden ontwikkeld met behulp van de unieke labelingchemie van 2-aminobenzoëzuur (2AA; antranilzuur, AA) voor het meten van activiteiten van zowel β1-4-galactosyltransferase (GalT-1) als α2-6-sialyltransferase (ST-6) door hoogwaardige vloeistof chromatografie (HPLC) met fluorescentiedetectie (Anumula KR. 2006. Vooruitgang in fluorescentiederivatiseringsmethoden voor hoogwaardige vloeistofchromatografische analyse van glycoproteïne-koolhydraten. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglucosamine (GlcNAc) en N-acetyllactosamine werden gebruikt als acceptoren en uridinedifosfaat (UDP)-galactose en cytidinemonofosfaat (CMP)-N-acetylneuraminezuur (NANA) als donoren voor respectievelijk GalT-1 en ST-6.Enzymatische producten werden in situ gelabeld met AA en werden gescheiden van de substraten op een TSKgel Amide 80-kolom met behulp van normale fase-omstandigheden.Enzymeenheden werden bepaald uit de piekgebieden door vergelijking met de gelijktijdig gederivatiseerde standaarden Gal-β1-4GlcNAc en NANA-a2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Lineariteit (tijd en enzymconcentratie), precisie (intra- en interassay) en reproduceerbaarheid voor de assays werden vastgesteld.De assays bleken nuttig te zijn bij het volgen van de enzymactiviteiten tijdens isolatie en zuivering.De assays waren zeer gevoelig en presteerden gelijk aan of beter dan de traditionele metingen op basis van radioactieve suiker.Het testformaat kan ook worden gebruikt voor het meten van de activiteit van andere transferasen, op voorwaarde dat de koolhydraatacceptoren een reducerend uiteinde bevatten voor labeling.Er werd een assay voor glycoproteïne-acceptoren ontwikkeld met behulp van IgG.Er werd een korte HPLC-profileringsmethode ontwikkeld voor de scheiding van IgG-glycanen (bitennaire G0, G1, G2, mono- en disialyleerd), die de bepaling van GalT-1- en ST-6-activiteiten op een snelle manier mogelijk maakte.Bovendien zou deze profileringsmethode nuttig moeten zijn voor het volgen van de veranderingen in IgG-glycanen in klinische omgevingen.