Producten

Om specifiek verschillende metabolieten van 5-fluorouracil (5-FU) en twee endogene monofosfaatnucleotiden te kwantificeren, hebben we een originele methode ontwikkeld op basis van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).Deze test maakte de bepaling mogelijk van: (i) de intracellulaire productie van 5-fluor-2'-deoxyuridine-5'-monofosfaat (5-FdUMP) uit 5-FU of 5-fluor-2'-deoxyuridine (5-FdUrd) , (ii) de impact van de 5-FdUMP-concentratie op de intracellulaire 2'-deoxyuridine-5'-monofosfaat (dUMP)/thymidine-5'-monofosfaat (TMP)-ratio, en (iii) de secretiegraad van 5-FdUMP en 5-FU uit menselijke gekweekte cellen door ABC-transporters.Onder onze experimentele omstandigheden werden cellen geïncubeerd met 5-FU of 5-FUrd.Vervolgens werden cellulaire eiwitten geprecipiteerd door methanol.Deze procedure zorgde voor een hoog extractieherstel.Om de secretie van 5-FU en 5-FdUMP uit cellen te meten, voerden we bovendien kwantificering van deze moleculen in kweekmedium uit.Media werden ofwel direct geïnjecteerd (5-FU) of ondergingen een vastefase-extractie met behulp van een Oasis Wax-extractiepatroon (5-FdUMP).Scheiding van analyten werd uitgevoerd op een dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm x 2,1 mm id) kolom met isocratische modus met behulp van ammoniumformiaatbuffer/methanol/water (5/5/90, v/v) als mobiele fase.De looptijd was niet langer dan 6,2 min.De analyten werden geïoniseerd in een elektrospray-interface onder negatieve ionenmodus.We hebben de methode gevalideerd over een bereik van 2,5–150 ng ml −1 volgens de verbindingen.De intra- en interassay-variabiliteit was gedurende zeven dagen lager dan 10%.Alle verbindingen waren stabiel in cellen of in kweekmedium wanneer monsters gedurende ten minste twee weken bij -20 ° C werden bewaard en na drie cycli van invriezen en ontdooien.In beide media werd geen matrixeffect waargenomen.