Producten

De analyse van proteoombrede fosforyleringsgebeurtenissen is nog steeds een grote analytische uitdaging vanwege de enorme complexiteit van eiwitfosforyleringsnetwerken.In dit werk evalueren we de complementariteit van Lys-N, Lys-C en trypsine met betrekking tot hun vermogen om bij te dragen aan de globale analyse van het fosfoproteoom.Een verfijnde versie van sterke kationenuitwisseling met een lage pH werd gebruikt om N-terminaal geacetyleerde, gefosforyleerde en niet-gemodificeerde peptiden efficiënt te scheiden.Een totaal van 5036 niet-redundante fosfopeptiden kon worden geïdentificeerd met een valse ontdekkingsgraad van <1% van 1 mg eiwit met behulp van een combinatie van de drie enzymen.Onze gegevens onthulden dat de overlap tussen de fosfopeptide-datasets gegenereerd met verschillende proteasen marginaal was, terwijl de overlap tussen twee vergelijkbaar gegenereerde tryptische datasets minstens 4 keer hoger bleek te zijn.Op deze manier maakte het parallelle gebruik van Lys-N en trypsine een toename van 72% mogelijk in het aantal gedetecteerde fosfopeptiden in vergelijking met alleen trypsine, terwijl een trypsine-replicatie-experiment slechts leidde tot een toename van 25%.Dus toen we ons uitsluitend op de trypsine- en Lys-N-gegevens concentreerden, identificeerden we 4671 niet-redundante fosfopeptiden.Verdere analyse van de gedetecteerde sites toonde aan dat de datasets van Lys-N en trypsine waren verrijkt met significant verschillende fosforyleringsmotieven, wat verder aantoont dat multiproteasebenaderingen zeer waardevol zijn in fosfoproteoomanalyses.