Producten

Eukaryote cellen bevatten een delicaat evenwicht van minieme hoeveelheden van de vier deoxyribonucleosidetrifosfaten (dNTP's), slechts voldoende voor een paar minuten DNA-replicatie.Zowel een deficiëntie als een overschot van een enkele dNTP kan resulteren in verhoogde mutatiesnelheden, foutieve DNA-reparatie of uitputting van mitochondriaal DNA.dNTP's worden gewoonlijk gekwantificeerd door een enzymatische test waarbij opname van radioactief dATP (of radioactief dTTP in de test voor dATP) in specifieke synthetische oligonucleotiden door een DNA-polymerase evenredig is met de concentratie van het onbekende dNTP.We vinden dat de veelgebruikte Klenow DNA-polymerase het overeenkomstige ribonucleotide kan vervangen door het onbekende dNTP, wat in sommige gevallen leidt tot een grote overschatting van dNTP's.We beschrijven nu testomstandigheden voor elke dNTP die opname van ribonucleotide vermijden.Voor de dTTP- en dATP-assays volstaat het om de concentraties van het Klenow-enzym en van gelabeld dATP (of dTTP) te minimaliseren;voor dCTP en dGTP moesten we het Klenow-enzym vervangen door het Taq DNA-polymerase of Thermo Sequenase.We suggereren dat in sommige eerdere rapporten ribonucleotide-opname mogelijk te hoge waarden voor dGTP en dCTP heeft veroorzaakt.