Producten

De manier waarop effecten van gelijktijdige mutaties zich combineren om de enzymatische activiteit te veranderen, is niet gemakkelijk te voorspellen omdat deze effecten niet altijd lineair additief zijn.Daarom kan de karakterisering van de effecten van gelijktijdige mutaties van aminozuurresiduen die het substraat binden, een belangrijke bijdrage leveren aan het begrip van de substraatspecificiteit van enzymen.In de bèta-glycosidase van Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) interageren beide residuen Q39 en E451 met het substraat en dit is essentieel voor het bepalen van de substraatspecificiteit.Dubbele mutanten van Sfbetagly (A451E39, S451E39 en S451N39) werden bereid door plaatsgerichte mutagenese, tot expressie gebracht in bacteriën en gezuiverd met behulp van affiniteitschromatografie.Deze enzymen werden gekarakteriseerd met behulp van p-nitrofenyl beta-galactoside en p-nitrofenyl beta-fucoside als substraten.De kcat/Km-ratio voor enkele en dubbele mutanten van Sfbetagly die plaatsgerichte mutaties bevatten op posities Q39 en E451 werd gebruikt om aan te tonen dat het effect op de vrije energie van ESdouble dagger (enzym-transition state complex) van de dubbele mutaties (Gdouble daggerxy) is niet de som van de effecten die het gevolg zijn van de enkelvoudige mutaties (Gdouble daggerx en Gdouble daggery).Dit verschil in Gdubbele dolk geeft aan dat de effecten van de enkele mutaties gedeeltelijk overlappen.Daarom telt dit gemeenschappelijke effect slechts één keer in Gdouble daggerxy.Kristallografische gegevens over bèta-glycosidasen onthullen de aanwezigheid van een tweetandige waterstofbinding met residuen Q39 en E451 en dezelfde hydroxylgroep van het substraat.Daarom suggereren zowel thermodynamische als kristallografische gegevens dat residuen Q39 en E451 een wederzijdse invloed uitoefenen op hun respectieve interacties met het substraat.