Producten

Eiwitfosforylering reguleert diverse cellulaire functies en speelt een sleutelrol in de vroege ontwikkeling van planten.Om eerdere onderzoeken van eiwitfosforylering in Arabidopsis-zaailingen aan te vullen en uit te breiden, gebruikten we een alternatieve benadering die eiwitextractie onder niet-denaturerende omstandigheden combineert met geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC) -verrijking van intacte fosfoproteïnen in extracten zonder Rubisco, gevolgd door identificatie met behulp van tweedimensionale gelelektroforese (2-DE) en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).In-gel trypsinedigestie en analyse van geselecteerde gelspots identificeerde 144 gefosforyleerde peptiden en residuen, waarvan slechts 18 fosfopeptiden en 8 fosfosieten werden gevonden in de PhosPhAt 4.0 en P3DB Arabidopsis thaliana fosforylatieplaatsdatabases.Meer dan de helft van de 82 geïdentificeerde fosfoproteïnen waren betrokken bij koolhydraatmetabolisme, fotosynthese/ademhaling of oxidatieve stressreactiemechanismen.Verrijking van intacte fosfoproteïnen voorafgaand aan 2-DE en LC-MS/MS lijkt de detectie van gefosforyleerde threonine- en tyrosineresiduen te verbeteren in vergelijking met methoden die verrijking op peptideniveau gebruiken, wat suggereert dat de twee benaderingen enigszins complementair zijn in termen van dekking van fosforylatieplaatsen.Door de resultaten voor jonge zaailingen te vergelijken met die eerder verkregen voor volwassen Arabidopsis-bladeren, werden vijf eiwitten geïdentificeerd die differentieel gefosforyleerd zijn in deze weefsels, wat het potentieel van deze techniek aantoont voor het onderzoeken van de dynamiek van eiwitfosforylering tijdens de ontwikkeling van planten.